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如何用濾膜法測(cè)細(xì)菌總數(shù)
點(diǎn)擊次數(shù):4666 更新時(shí)間:2023-05-08

基于濾膜上細(xì)菌直接計(jì)數(shù)法的細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)
【摘要】 細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)在質(zhì)量監(jiān)測(cè)中具有重要的意義,目前除了經(jīng)典的平板培養(yǎng)法以外,還有微菌落法、阻抗法等快速檢測(cè)方法,這些方法或者需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間,或者需要較高的檢測(cè)成本。本研究提出一種不需要培養(yǎng)而在濾膜上直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)的快速檢測(cè)方法,它主要分為過(guò)濾、染色、顯微鏡計(jì)數(shù)和計(jì)算四個(gè)步驟。計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí),根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn),對(duì)傳統(tǒng)公式進(jìn)行改進(jìn),提出按區(qū)域計(jì)算細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算方法,提高了檢測(cè)精度。研究結(jié)果表明,該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無(wú)顯著性差異(t=0.847,P=0.436>0.05),是一種低成本、快速的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
1 引 言
細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)的研究已有很多,目前國(guó)標(biāo)規(guī)定的方法為平板計(jì)數(shù)法,該方法是將樣品加入瓊脂營(yíng)養(yǎng)基,在37 ℃下培養(yǎng)24~48 h后計(jì)數(shù)。這種方法精度高,但耗時(shí)長(zhǎng),難以滿足實(shí)際工作需要。為了簡(jiǎn)化檢測(cè)程序、縮短檢測(cè)時(shí)間,國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的快速檢測(cè)方法的研究,提出了阻抗檢測(cè)法〔1〕、Simplate TM全平器計(jì)數(shù)法〔2〕、微菌落技術(shù)〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢測(cè)方法,取得了的成果,但檢測(cè)時(shí)間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎(chǔ)上,提出了在濾膜上染色后,直接計(jì)數(shù)的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法,具體步驟為:用集菌儀進(jìn)行細(xì)菌收集→在膜上進(jìn)行染色→在油鏡下計(jì)數(shù)→按公式計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無(wú)顯著性差異,檢測(cè)時(shí)間約1 h,是一種快速的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗(yàn)材料有集菌儀(杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司),染色劑,生物顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司),聚碳酸脂膜(直徑47 mm)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 準(zhǔn)備工作 卸下集菌儀的濾網(wǎng)(見圖1),統(tǒng)計(jì)濾網(wǎng)上小孔總數(shù),為計(jì)算菌液濃度做準(zhǔn)備。另外,還需對(duì)集菌儀中的集菌器進(jìn)行高壓滅菌,以防止過(guò)濾過(guò)程中引入外源細(xì)菌。
2.2.2 細(xì)菌收集 取濃度的霉菌菌液300~500 ml,裝在集菌儀上,集菌儀采用蠕動(dòng)加壓方式對(duì)菌液施加的壓力,使菌液流過(guò)孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過(guò)濾方法是因?yàn)樗梢允辜?xì)菌相對(duì)均勻地分布在濾膜上,而選用聚碳酸脂膜是因?yàn)檫@種膜具有良好的透光性,便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜,切下一部分放在載玻片上,進(jìn)行染色、固定。染色的目的是增大細(xì)菌與背景的對(duì)比度,便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計(jì)數(shù)與計(jì)算 菌液經(jīng)集菌儀過(guò)濾后,細(xì)菌在濾膜上的分布見圖2、圖3,由圖可以看出細(xì)菌分布具有以下兩個(gè)特點(diǎn):一是細(xì)菌集中在一個(gè)個(gè)的圓形區(qū)域內(nèi),這些圓形區(qū)域和擋板的小孔相對(duì)應(yīng);二是各個(gè)圓形區(qū)域之間細(xì)菌很少。根據(jù)膜上細(xì)菌分布的這種特點(diǎn),提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝贿M(jìn)行計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)出圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù),從而計(jì)算出菌液中細(xì)菌總數(shù)。具體步驟如下:隨機(jī)選擇10個(gè)圓形區(qū)域,在油鏡下,調(diào)節(jié)焦距以獲得較清晰的圖像(見圖4),統(tǒng)計(jì)每個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)的細(xì)菌個(gè)數(shù),然后按公式(1)計(jì)算出菌液的濃度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細(xì)菌的區(qū)域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細(xì)菌的區(qū)域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細(xì)菌染色后圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中:X表示待檢菌液濃度(CFU/ml)
A表示10個(gè)圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌總數(shù)
N表示濾網(wǎng)上小孔總數(shù)
V表示集菌時(shí)所用待檢菌液體積(ml)
3 結(jié)果與討論
3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
按上述方法計(jì)算得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法得到的結(jié)果見表1。表1 兩種方法得到的細(xì)菌總數(shù)
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6染色鏡檢
(cfu/ml)185168157165171166平板培養(yǎng)
(cfu/ml)176155165158183152
對(duì)表1中兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),在α=0.05時(shí),雙尾檢驗(yàn)結(jié)果如下:t=0.847,P=0.436>0.05,說(shuō)明兩種方法得到的結(jié)果無(wú)顯著性差異。
3.2 討論
3.2.1 計(jì)算公式的改進(jìn) 用集菌儀對(duì)樣本菌液進(jìn)行過(guò)濾時(shí),由于濾網(wǎng)擋板的作用,使得細(xì)菌不是均勻地分布在整個(gè)濾膜上,而是集中分布在濾網(wǎng)的小孔處,所以,計(jì)算細(xì)菌總數(shù)時(shí),不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V(其中Φ1,Φ2分別為濾膜直徑和視野直徑),該公式是微菌落方法檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)中的常用計(jì)算公式。在本實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)細(xì)菌分布的特點(diǎn),提出以圓形區(qū)域?yàn)閱挝挥?jì)算細(xì)菌總數(shù)的思路,使計(jì)算結(jié)果更接近真實(shí)值,從而提高了檢測(cè)精度。
3.2.2 細(xì)菌大小的影響 細(xì)菌大小對(duì)本實(shí)驗(yàn)的影響主要體現(xiàn)在鏡檢時(shí),如果細(xì)菌太小,顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí)不能將細(xì)菌從背景中分辨出來(lái),我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不能分辨大腸桿菌和葡萄球菌,而較大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 檢測(cè)時(shí)間進(jìn)一步縮短 細(xì)菌總數(shù)的經(jīng)典檢測(cè)方法是平板培養(yǎng)法,得到的結(jié)果精度高,但是它所用時(shí)間長(zhǎng),為了縮短檢測(cè)時(shí)間,出現(xiàn)了微菌落法,將檢測(cè)時(shí)間縮短為4 h左右〔3-5〕。本研究不對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng),而是在膜上染色后直接用顯微鏡計(jì)數(shù),大限度地縮短了檢測(cè)時(shí)間,使整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在1 h左右。
4 結(jié)論
本研究用集菌儀將菌液過(guò)濾后,取濾膜一部分進(jìn)行染色、制片,然后在油鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)菌個(gè)數(shù)。根據(jù)細(xì)菌在濾膜上的分布特點(diǎn),提出將圓形區(qū)域作為統(tǒng)計(jì)單位,得到圓形區(qū)域內(nèi)細(xì)菌的平均個(gè)數(shù),從而計(jì)算出菌液濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,按照該方法得到的結(jié)果與平板培養(yǎng)法的結(jié)果無(wú)顯著性差異。與平板培養(yǎng)法和微菌落法相比,該方法不需要細(xì)菌培養(yǎng),檢測(cè)時(shí)間只需要1 h左右,明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間,是一種快速、有效的細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)方法。

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